Skip to main content

Odseki

J1-4400 Vrednotenje prehodnih stanj proteinov

Vsebinski opis projekta:

Kljub nedavnemu napredku biofizikalnih in računskih pristopov za preiskavo biomolekularnih sistemov je karakterizacija dinamičnega ravnovesja proteinskih stanj še vedno zahteven izziv. Problem je izmuzljiva narava  dinamičnih procesov, ki uravnavajo to ravnovesje. Predvsem je težko na atomski ravni določiti nizko zasedena, prehodna stanja, ker so »nevidna« za biofizikalne metode, ki zaznavajo proteinska stanja z najnižjo energijo ali največjo zasedenostjo. Vse več je dokazov o pomenu prehodnih, nizko zasedenih, termično dostopnih proteinskih stanj za biološko delovanje proteinov.

Glavni cilj predlaganega projekta je razvoj kombiniranega eksperimentalno teoretičnega pristopa za fizikalno-kemijsko karakterizacijo prehodnih proteinskih stanj blizu fiziološkim razmeram v vodnih okoljih na atomski ravni. Karakterizacija bo omogočila, njihovo povezavo z določenim dinamičnim dogodkom, ki je pomemben za njihovo funkcijo. Za premagovanje težav povprečevanja in asignacije  signalov bomo uporabili kombinacijo NMR in vibracijske spektroskopije, ki delujeta na različnih časovnih skalah. Ti spektroskopiji lahko skupaj zagotovita dostop do prehodnih molekularnih stanj, ki so  v dinamični izmenjavi na časovni lestvici od pikosekund do milisekund. Za  razumevanje korelacije med posameznimi vrstami gibanja in njihovim učinkom na dinamično ravnovesje stanj, bomo uporabili atomistične simulacije molekularne dinamike. Razvili bomo algoritme za numerično analizo korelacije med eksperimentalnimi in računskimi rezultati, da bi razumeli vpliv posameznih prispevkov sklopljenih gibanj na porazdelitev proteinskih stanj. Proučevali bomo proteine iz različnih družin, ki zajemajo širok spekter dinamičnih dogodkov, ki lahko povzročijo prehode med termično dostopnimi stanji proteinov. Funkcionalne vloge izbranih proteinov v bioloških procesih ni mogoče celovito razumeti, ne da bi preučili dinamično ravnovesje med njihovimi možnimi stanji brez in/ali z njihovimi vezavnimi partnerji. Pričakovani rezultati lahko zagotovijo trenutno nepredvidljiv vpogled v delovanje teh proteinov v zdravem in bolezenskem stanju.

Razviti pristop bo široko uporaben za opredelitev prehodnih proteinskih stanj na atomski ravni v vodnih okoljih. Rezultati predlaganih študij lahko znatno prispevajo k razumevanju delovanja proteinov  v zdravem in bolezenskem stanju ter bodo zelo zanimivi za veliko specifičnih raziskovalnih področij, kot so molekularno prepoznavanje, molekularna signalizacija, encimska kataliza, reakcije zvitja in vezave  proteinov ter tarčno načrtovanje in odkrivanje zdravilnih učinkovin.

 

Sodelujoče organizacije:

  • Univerza v Ljubljani, Fakulteta za farmacijo

           a. osnovni podatki glede financiranja:

Projekt financira ARRS v okviru cenovne kategorije B za obdobje treh let v obsegu 2481 letnimi urami za obdobje 3 let. Pričetek financiranja je 1. 10. 2022.

           b. sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS

Na Kemijskem inštitutu v projektni skupini sodelujejo:

Simona Golič Grdadolnik; SICRIS št. 08329;

Franci Merzel; SICRIS št. 13627

Jože Grdadolnik; SICRIS št. 08523

Tjaša Goričan; SICRIS št. 39078

Barbara Zupančič; SICRIS št. 28608

Gregor Anderluh; SICRIS št. 15686

Iza Ogris; SICRIS št. 50459

Neli Sedej; SICRIS št. 54913

Aljoša Marinko; SICRIS št. 57301

Na Fakulteti za farmacijo, Univerze v Ljubljani v projektni skupini sodelujejo:

Stanislav Gobec; SICRIS št. 15284

Tihomir Tomašić; SICRIS št. 28334

Izidor Sosič; SICRIS št. 30816

Martina Hrast Rambaher; SICRIS št. 32036

Živa Zajec; SICRIS št. 53670

 

Faze projekta in njihova realizacija

Delo na projektu smo organizirali v tri delovne pakete (DP).

DP1: Identifikacija in vrednotenje prehodnih konformacijskih stanj aegerolizinov z intrinzično neurejenimi regijami.

Zaradi slabše stabilnosti proteinov phiatt in fusver smo začrtane študije izvedli najprej na bolj stabilnem proteinu PpNPP1, ki omogoča izvedbo širšega nabora NMR eksperimentov na izotopsko označenem proteinu in je prav tako sestavljen iz urejenih in neurejenih regij, ki so lahko pomembne za interakcijo z lipidi. Pridobljena znanja so nam omogočila določiti nabor parametrov primernih za izvedbo NMR eksperimentov na manj stabilnih proteinih. Izvedli smo asignacijo signalov glavne verige in stranskih verig PpNPP1 in določili strukturo urejenega dela proteina v tekočini.  Z NMR metodami smo opredelili tudi interakcijo različnih lipidov z PpNPP1. Identificirali smo dva časovna razreda izmenjave med konformaciji stanji neurejenega dela PpNPP1 od nekaj sto milisekund do sekunde in od  mikro- do milisekund, ki lahko vplivajo na vezavo lipidov. Delno so izvedeni 15N NMR relaksacijski eksperimenti proteinov fusver, phiatt in PpNPP1.  Izvedeli smo biofizikalna opredelitev aktivnosti in lipidnih interakcij proteinov fusver, phiatt in PpNPP1.

DP2: Identifikacija in vrednotenje prehodnih konformacijskih stanj MurD v povezavi z vezavo substrata in zaviralca.

Uspešno smo pripravili kompleksno izotopsko označen MurD v dveh različnih shemah izotopskega označevanja in izvedli NMR meritve za asignacijo metilnih skupin AILVproR. To so 3D metil-metil NOESY za asignacijo metilnih skupin preko prostorskih povezav izveden na (U)-2H15N-selektivno 13CH3 izotopsko označenem MurD ter 3D out-and-back-13C-TOSCY in 3D HNCA za komplementarno asignacijo metilnih skupin preko glavne verige proteina izveden na (U)-2H-13C 15N-selektivno izotopsko označenem MurD. Izvedli smo obsežne simulacije molekularne dinamike samega MurD in enajstih kompleksov MurD s substrati in zaviralci. V vseh simulacijah so bila prisotna redko zasedena stanja, med osnovnimi stanji pa smo identificirali tudi zelo zaprto konformacijo MurD, ki do sedaj eksperimentalno še ni bila opažena. V nadelavanju projekta bomo z NMR metodami preko metilnih skupin eksperimentalno opredelili različna konformacijama stanja MurD. Z merjenjem NMR relaksacijskih parametrov glavne verige MurD in določanjem spektralne gostote za karakterizacijo frekvenčnega spektra gibanja N-H vektorjev smo že ugotovili, da na določenih delih  glavne verige poteka izmenjava med konformacijskimi stanji na mikro- do milisekundni časovni skali, kar je značilno za izmenjavo med osnovnim in višje energijski prehodnimi stanji. Izmenjavo na tej časovni skali smo identificirali tako v prostem MurD  kot tudi v kompleksih s substratom in zaviralcem.

DP3: Identifikacija in vrednotenje prehodnih konformacijskih stanj NGF v povezavi z vezavo majhnih endogenih ligandov.

Z uporabo komplementarnih biofizikalnih eksperimentalnih metod smo identificirali in na atomskem nivoju opredelili vezavo ATP in divaletnih ionov na rhNGF in njegov prekurzor pro-rhNGF ter določili njihov vpliv na interakcijo z receptorji. Pokazali smo, da se ATP veže na intrinzično neurejen propeptid proNGF z mikromolarno disociacijo konstantno, za razliko  od šibke milimoralne vezave ATP na rhNGF. Ugotovili smo, da vezava ATP inducira konformacijsko preureditev fleksibilne propeptidne domene proNGF, kar nakazuje, da ATP deluje kot alosterični modulator celotne konformacije proNGF. Dokazali smo, da Mg2+, ki ima poznano fiziološko vlogo pri nevronih, modulira interakcijo ATP/proNGF. Nadaljujemo z opredelitvijo interakcije endogenih lipidov z rhNGF.

Bibliografske reference, ki izhajajo neposredno iz izvajanja projekta

Izvirni znanstveni članki:

1. PAOLETTI, Francesca, COVACEUSZACH, Sonia, CASSETTA, Alberto, CALABRESE, Antonio N., NOVAK, Urban, KONAREV, Peter, GRDADOLNIK, Jože, LAMBA, Doriano, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona. Distinct conformational changes occur within the intrinsically unstructured pro-domain of pro-Nerve Growth Factor in the presence of ATP and Mg2+. Protein science. vol. 32, iss. 2, e4563, str. 1-14, ilustr. ISSN 1469-896X. https://onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/pro.4563DiRROS - Digitalni repozitorij raziskovalnih organizacij Slovenije, DOI: 10.1002/pro.4563. [COBISS.SI-ID 139671043]

2. DIAMANTIS, Dimitrios A., TSIAILANIS, Antonios D., PAPAEMMANOUIL, Christina, NIKA, Maria-Christina, KANAKI, Zoi, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona, BABIČ, Andrej, TZAKOS, Eleftherios Paraskevas, FOURNIER, Isabelle, SALZET, Michel, KUSHWAHA, Prem Prakash, THOMAIDIS, Nikolaos S., RAMPIAS, Theodoros, SHANKAR, Eswar, KARAKURT, Serdar, GUPTA, Sanjay Kumar, TZAKOS, Andreas G. Development of a novel apigenin prodrug programmed for alkaline-phosphatase instructed self-inhibition to combat cancer. Journal of biomolecular structure & dynamics. 28. Aug. 2023, str. 1-22, https://www.tandfonline.com/doi/epdf/10.1080/07391102.2023.2247083?needAccess=true&role=buttonDOI: 10.1080/07391102.2023.2247083. [COBISS.SI-ID 163337219]

Predstavitve na konferencah:

1. PAOLETTI, Francesca, MERZEL, Franci, COVACEUSZACH, Sonia, CASSETTA, Alberto, CALABRESE, Antonio N., OGRIS, Iza, NOVAK, Urban, KONAREV, Peter, GRDADOLNIK, Jože, LAMBA, Doriano, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona. Differential interactions between ATP and NGF / proNGF: chance or necessity? V: 62° congress SIB : 7-9 September [2023], Firenze : abstract book. [S. l.: s. n.], 2023. Str. 42. https://www.congressosib2023.it/wp-content/uploads/2023/09/Abstract-Book_CongressoSIB-2023.pdfhttps://www.congressosib2023.it/abstract-book/. [COBISS.SI-ID 176813315]

2. ŽIBRAT, Nika, PODOBNIK, Marjetka, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona, ANDERLUH, Gregor. Phytophthora parasitica NLP shares three-dimensional fold and pore-forming activity of model Nep1-like protein, NLPPya. V: SEPČIĆ, Kristina (ur.), PAVŠIČ, Miha (ur.). 15th Meeting of the Slovenian Biochemical Society with International Participation = 15. srečanje Slovenskega biokemijskega društva z mednarodno udeležbo : book of abstracts = zbornik povzetkov : Portorož, 20-23 September 2023 = [20.–23. september 2023, Portorož, Slovenija]. Ljubljana: Slovenian Biochemical Society: = Slovensko biokemijsko društvo, 2023. Str. 171. ISBN 978-961-95941-1-7. https://portoroz2023.sbd.si/upload/docs/SBD2023_Portoroz-Book_of_Abstracts.pdf. [COBISS.SI-ID 170124035]


3. HERLAH, Barbara, OGRIS, Iza, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona, SOSIČ, Izidor, GOBEC, Stanislav, PERDIH, Andrej. Simulation-based optimization of 4,6-substituted-1,3,5-triazin-2(1H)-ones as catalytic inhibitors of the human DNA Topoisomerase IIΑ. V: Abstracts book : Lisbon 2023, at the edge of Europe and Science. [S. l.]: [s. n.], 2023. Str. 88. https://annualmeeting.eufeps.org/programme.html. [COBISS.SI-ID 156434691].

4. DERNOVŠEK, Jaka, GORIČAN, Tjaša, ZAJEC, Živa, ZIDAR, Nace, ILAŠ, Janez, URBANČIČ, Dunja, ZUBRIENÉ, Asta, MATULIS, Daumantas, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona, TOMAŠIČ, Tihomir. Development of new HSP90β-selective inhibitors based on topoisomerase II ligands. V: JAKOPIN, Žiga (ur.), TOMAŠIČ, Tihomir (ur.). Crossing the Boundaries of Medicinal Chemistry : book of abstracts : University of Ljubljana, Faculty of Pharmacy, September 28, 2023. Ljubljana: Fakulteta za farmacijo, 2023. Str. 21, ilustr. ISBN 978-961-6378-95-6. https://www.ffa.uni-lj.si/docs/default-source/e-knjige/book-of-abstracts---crossing-the-boundaries-of-medicinal-chemistry.pdf?sfvrsn=2. [COBISS.SI-ID 173421059]


5. HERLAH, Barbara, OGRIS, Iza, GOLIČ GRDADOLNIK, Simona, GOBEC, Stanislav, SOSIČ, Izidor, PERDIH, Andrej. Structure-based optimization of 4,6-substituted-1,3,5-triazin2(1H)-ones as catalytic inhibitors of human DNA topoisomerase IIα. V: PINTAR, Albin (ur.). Slovenski kemijski dnevi 2023 = 29th Annual Meeting of the Slovenian Chemical Society : zbornik povzetkov = book of abstracts : 13.-15. september 2023, Portorož, Portorose, Slovenija. Ljubljana: Slovensko kemijsko društvo, 2023. Str. 118. ISBN 978-961-95922-2-9. https://www.conftool.org/scs-annual-meeting-2023/index.php?page=browseSessions&form_session=47#paperID119https://www.conftool.org/scs-annual-meeting-2023/index.php/Herlah-Structure-based_optimization_of_4%2C6-substituted-1%2C3%2C5-triazin-2-119.pdf?page=downloadPaper&filename=Herlah-Structure-based_optimization_of_4%2C6-substituted-1%2C3%2C5-triazin-2-119.pdf&form_id=119. [COBISS.SI-ID 167932931]
 

Za slepe in slabovidne(CTRL+F2)
barva kontrasta
velikost besedila
označitev vsebine
povečava