Molekulski mehanizmi poškodb lipidnih membran, ki jih povzročajo porotvorni proteini
Proteini, ki tvorijo pore (ang. Pore-forming proteins — PFP) zmotijo normalno delovanje bioloških membran tako da vplivajo na njihovo celovitost in selektivno prepustnost. Izražajo jih organizmi vseh kraljestev življenja. V večini primerov igrajo vlogo pri napadu ali obrambi in tako delujejo kot toksini, pri nekaterih organizmih pa so ugotovili, da so vključeni v imunski odziv, razvoj ali prebavo. PFP so vodotopni monomeri, ki se specifično ali nespecifično vežejo bodisi na lipide, sladkor ali beljakovinske komponente ciljnih membran. Na membrano vezani monomeri se nato zlijejo v strukturirane oligomere, čemur sledijo usklajene konformacijske spremembe v vseh protomerih, kar povzroči nastanek funkcionalnih transmembranskih por. Transmembranski kanali teh por so zgrajeni iz simetričnih α-vijačnih skupkov ali β-sodčkov, na osnovi česar jih delimo v α- ali β-PFP.
Zanimajo nas molekularni mehanizmi poškodb membran zaradi tvorbe proteinskih por. Proučujemo molekularne interakcije PFP z lipidnimi membranami in iščemo specifične receptorje, ki vplivajo na njihovo aktivnost tvorbe por, z uporabo različnih biokemijskih in biofizikalnih pristopov. Poleg tega analiziramo zgradbe topnih monomerov in membranskih por z X-žarkovno kristalografijo in krio-transmisijsko elektronsko mikroskopijo.
Določili smo kristalno zgradbo por, ki jih tvori lizenin, član aerolizinske družine PFP iz deževnika, in opisali njegov mehanizem sestavljanja v kompaktne pore v membranah, bogatih s sfingomielinom (Podobnik in sod., 2016). Poleg biološkega pomena je ta študija pokazala tudi potencial teh por za uporabo v nanobiotehnologiji. Izkoristili smo naravno pH odvisen mehanizem tvorbe por z listeriolizinom O (LLO), citolizinom, ki je odvisen od holesterola (CDC). S proteinskim inženiringom smo pripravili mutantni protein LLO s strogo regulirano pH odvisnostjo (Kisovec in sod., 2017). Pripravili smo LLO znotraj veziklov celične velikosti (GUV), narejenih iz arhejskih lipidov v izvenceličnem sistemu, kar bi lahko bilo koristno za aplikacije v sintezni biologiji (Rezelj in sod., 2018). Zanima nas tudi evolucija domen PFP, odgovornih za vezavo na membrane. Z uporabo metode in vitro evolucije vezavnih mest za lipide z uporabo predstavitve na ribosomih, smo odkrili sspecifične proteinske inhibitorjev PFP (Omersa in sod., 2020). To metodo smo uporabili tudi pri odkritju atipičnih različic membraneske vezavne domene člana družine CDC, perfringolizina O (Šakanović in sod., 2020). Poleg tega smo prvi odkrili glikolipidne receptorje (GIPC) aktinoporinom podobnih Nep1 proteinov (NLP), ki jih izražajo oomicete, glive in bakterije, in so toksični za (ekonomsko pomembne) rastline. Opisali smo njihov mehanizem delovanja ter opisali razlike v tridimenzionalni zgradbi med toksičnimi in netoksičnimi člani te skupine, ter predlagali potencialne inhibitorje teh rastlinskih toksinov (Lenarčič in sod., 2017, 2019; Pirc in sod., 2021, 2022). Določili smo tudi kristalno zgradbo egerolizina iz človeškega patogena Pseudomonas aeruginosa in njegovo interakcijo z membranskim receptorjem ceramidnim fosfo-etanolaminom (Kočar in sod., 2017). Pokazali smo, da gliva Beauveria bassiana, ki je učinkovina bioinsekticidov, proizvaja egerolizin BlyA, ki interagira z membranskim lipidom, ceramidnim fosfo-etanolaminom, specifičnim za žuželke (Kraševec in sod., 2021).
