Odseki

Šifra projekta: J1-9174

Obdobje trajanja projekta: 1.7.2018 - 30.6.2021

Vodja: izr. prof. dr. Marjetka Podobnik

1. VSEBINSKI OPIS PROJEKTA:

   Listeria monocytogenes je fakultativno intracelularna bakterija, in je glavni vzrok resne bolezni, ki se prenaša s hrano, in prizadene predvsem posameznike z oslabljenim imunskim sistemom. Čeprav ljudje redko obolijo, pa je smrtnost visoka, in sicer 20-30%. Zelo pomembnen podatek je, da je listerioza veliko bolj pogosta pri domačih živalih (sesalci in perjad), še posebej pa pri prežvekovalcih. Listeriozo lahko pri ljudeh in živalih sicer zdravimo tudi z antibiotiki, v primeru zgodnje diagozne, vendar je lahko kljub temu precej usodna, predvsem za živali.

   Virulenco L. monocytogenes omogoča zelo kompleksen in koordiniran intracelularni življenjski cikel, ki je sestavljen iz več korakov: adhezija na gostiteljevo celico, invazija, znotrajcelično pomnoževanje in gibanje ter razsejanje med celicami. Celovitost vsakega koraka je odvisna od orkestrirane aktivnosti specializiranih bakterijskih faktorjev, ki jih zelo natančno kontrolirajo specifični regulatorji.

   Ko se bakterija po internalizaciji znajde v tarčni celici v fagosomski vakuoli, uporabi listeriolozin O (LLO) in dve fosfolipazi, PI-PLC in PC-PLC, za razparanje vakuole, pobeg iz nje ter rasejanje med celicami, kar so ključni koraki v patogenezi L. monocytogenes. Razpad vakuolne membrane povzroči LLO s svojo porotvorno aktivnostjo, to pa je dejansko ključni dogodek med bakterijsko infekcijo, medtem pa ko fosfolipazi delujeta kot podpora LLO za uspešno virulenco.

   LLO se izloča kot topen monomeren protein, ki se veže na membrane z visoko koncentracijo holesterola. Po vezavi na membrano se začne sestavljati v oligomerne strukture, ki se nato vgreznejo v lipidni dvosloj membran, pri tem nastanejo funkcionalne transmembranske pore. V nasprotju s homolognimi toksini iz drugih patogenih bakterij, pa LLO ne tvori tipičnih obročastih por z notranjim premerom okoli 40 nm, ampak namesto tega naredi transmembranske razpoke neregularnih oblik in velikosti, ki na koncu dosežejo dimenzije, ki bi lahko služile za pobeg bakterij iz vakuol.

   Do sedanje raziskave naše skupine in drugih so pokazale, da je mehanizem nastanka por odvisen od vplivov okolja, kot je temperatura, pH in lipidna sestava membrane. Medtem ko so te raziskave pomembno prispevale k razumevanju mehanizma delovanja LLO, pa še vedno nimamo podatkov, ki bi nam prikazovali to edinstevno plastičnost LLO por in odvisnost le te od zunanjih dejavnikov, pri visoki ločljivosti. Ravno tako še niso znane podrobnosti vpliva bakterijskih fosfolipaz na membrane, ravno tako ne tudi strukture in mehanizem delovanja na molekularnem nivoju, pa tudi sodelovanje z LLO.

   Zato želimo s to predlagano raziskavo odgovoriti na ta nerešena vprašanja z uporabo širokega spektra modernih metodoloških pristopov, od molekularne biologije, proteinske in lipidne biokemije in biofizike, do strukturne biologije, vključno z x-žarkovno kristalografijo in krio-elektronsko mikroskopijo. Verjamemo, da bo predlagana razsikava jasno pokazala pomembne lastnosti LLO por, kot je plastičnost, ki je pomembna za natačen potek dogodkov med infekcijo z L. monocytogenes. Poudariti moramo, da želimo doseči podatke blizu atomske ločljivosti, kar bo doprineslo ključen in podroben vpogled v tvorbo pore z LLO, kot sam ali pa skupaj z obema fosfolipazama, kar je nujno za razumevanje dogodkov in vivo med infekcijo. To bo ključno prispevalo k razumevanju listerijske patogeneze in s tem razvoju terapetvskih strategij za preprečevanje širjenja L. monocytogenes ter s tem sistemske infekcije ljudi in živine.

2. SODELUJOČE ORGANIZACIJE:
   Univerza v Ljubljani, Biotehniška fakulteta
    
3. Osnovni podatki glede financiranja:
   Projekt financira ARRS v okviru cenovne kategorije C za obdobje treh let v obsegu 2556 letnih ur. Pričetek financiranja je 1.7.2018
    
4. Sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS:

   Na Kemijskem inštitutu v projektni skupini J1-9174 sodelujejo (v letu 2021):

   38255; Andeja Kežar
   53439; Magdalena Kulma
   12048; Marjetka Podobnik
   38479; Aleksandra Šakanović
   38473; Tomaž Švigelj

   Na Biotehniški fakulteti v projektni skupini J1-9174 sodelujejo (v letu 2021):

   24290; Matej Butala
   32099; Maja Grundner
   35371; Maja Hostnik
   33923; Polona Mrak
   15328; Kristina Sepčić
   16381; Nada Žnidaršič
   
    
5. Faze projekta in njihova realizacija

   Projekt je sestavljen iz štirih ciljev. Pri raziskavah uporabljamo širok spekter modernih metodoloških pristopov, od molekularne biologije, proteinske in lipidne biokemije in biofizike, do strukturne biologije, vključno z x-žarkovno kristalografijo in (krio-)elektronsko mikroskopijo.

   Cilj 1 Priprava rekombinantnih proteinov.
   
   Cilj 2 Določitev kristalne strukture PC-PLC.
   
   Cilj 3 Vezava in vpliv LLO, PI-PLC in PC-PLC na različne lipidne membranske sisteme.
   
   Cilj 4 Opazovanje nastanka por z LLO v prisotnosti fosfolipaz s pomočjo krio-EM.

   Realizacija, julij 2022:
   Celoten raziskovalni projekt lahko označimo kot zelo uspešen. Pridobili smo veliko originalnih in izvirnih rezultatov, ki dodatno prispevajo k razumevanju mehanizma patogeneze L. monocytogenes.
   Čeprav smo morda na področju raziskav ene od fosfolipaz (PI-PLC) dosegli malo manj rezultatov, kot pričakovano, smo na področju druge fosfolipaze (PC-PLC) v veliki meri presegli pričakovane rezultate. Zato lahko zaključimo, da je izpolnitev celotnega projekta 100 %. Naši rezultati so bili v obliki predavanja predstavljenih na treh pomembnih mednarodnih konferencah (ISOPOL in 2 x FEBS), na več drugih konferencah pa tudi v obliki postrov. Vedno je bilo zelo veliko ineteresa za naše delo. Trenutno zaključujemo en večji članek z vsebino projekta, en pregledni članek pa je bil že objavljen. Poleg tega tega s tega področja zaključujemo en doktorat, uspešno pa so se na tej tematiki urili magistrski študentje/ke. Delo prinaša tudi odlične temelje za nadaljnje raziskave, ki jih tudi že načrtujemo.

    

6. Bibliografske reference, ki izhajajo neposredno iz izvajanja projekta

    

   [1] PETRIŠIČ, Nejc, ADAMEK, Maksimiljan, ANDERLUH, Gregor, PODOBNIK, Marjetka. Listerial PC-PLC is a critical virulence factor for phagosomal membrane disintegration. FEBS open bio, The Biochemistry Global Summit, 25th IUBMB Congress, 46th FEBS Congress, 15th PABMB Congress, July 9–14, 2022, Lisbon, Portugal. vol. 12, suppl. s1, str. 9. febs.onlinelibrary.wiley.com/doi/epdf/10.1002/2211-5463.13442 [COBISS.SI-ID 115145475]
   
   [2] PETRIŠIČ, Nejc, ADAMEK, Maksimiljan, KEŽAR, Andreja, ANDERLUH, Gregor, PODOBNIK, Marjetka. Lipid membrane as an interaction interface of the two major listerial virulence factors. European biophysics journal, 13th European Biophysics Conference, 24-28 July 2021, Vienna, Austria, 50, suppl. 1, 186. COBISS.SI-ID 72676611]
   
   [3] PETRIŠIČ, Nejc, ANDERLUH, Gregor, PODOBNIK, Marjetka. Structure-function relationship of broad-range phospholipase C from Listeria monocytogenes. Molecules of life: towards new horizons: FEBS 2021: the 45th FEBS Congress: 3-8 July 2021, Ljubljana, Slovenia: virtual: abstracts, str. [1]. 2021.febscongress.org/abstract_preview.aspx. [COBISS.SI-ID 70465283]
   
   [4] ANDERLUH, Gregor, KOZOROG, Mirijam, PETRIŠIČ, Nejc, KISOVEC, Matic, PODOBNIK, Marjetka. Listeriolysin O interactions with lipid membranes. V: Abstracts. 20th International Symposium on Problems of Listeria and Listeriosis, September 24 - 27 2019, Toronto, Canada. Str. 35. [COBISS.SI-ID 40232965]
   
   [5] PETRIŠIČ, Nejc, ANDERLUH, Gregor, PODOBNIK, Marjetka. Structural insights into broad-range phospholipase C from Listeria monocytogenes. V: Abstracts. 20th International Symposium on Problems of Listeria and Listeriosis, September 24 - 27 2019, Toronto, Canada. Str. 149. [COBISS.SI-ID 40233221]
   
   [6] PETRIŠIČ, Nejc, ANDERLUH, Gregor, ADAMEK, Maksimiljan, PODOBNIK, Marjetka. Mechanisms of action and interplay of three key virulence factors of Listeria monocytogenes. V: KISOVEC, Matic (ur.). Book of abstracts. 13th Meeting of the Slovenian Biochemical Society with International Participation, Dobrna, 24 - 27 September 2019. Str. 69. [COBISS.SI-ID 6729242]
   
   [7] PETRIŠIČ, Nejc, ANDERLUH, Gregor, PODOBNIK, Marjetka. Molecular mechanisms of action and interplay between three key toxins of Listeria monocytogenes. V: ANDERLUH, Gregor (ur.), PIRC, Katja (ur.), SEPČIĆ, Kristina (ur.). Recent topics in toxinology: 7. 6. 2019 Ljubljana: [book of abstracts]. Str. 48 [COBISS.SI-ID 6656282]
   
   [8] PETRIŠIČ, Nejc, ANDERLUH, Gregor, PODOBNIK, Marjetka. Structural and functional studies of the interplay between three virulence factors from Listeria monocytogenes. V: DELAČ MARION, Ida (ur.). ABC of physics of life: book of abstracts. 14th Greta Pifat Mrzljak International School of Biophysics, University of Split, Croatia, Aug. 23-Sept. 2018. Str. 101. [COBISS.SI-ID 6563098]
   
   [9] PETRIŠIČ, Nejc, KOZOROG, Mirijam, ADEN, Saša, PODOBNIK, Marjetka, ANDERLUH, Gregor. The molecular mechanisms of listeriolysin O-induced lipid membrane damage. Biochimica et biophysica acta. Biomembranes. 2021, vol. 1863, 183604-1-183604-15. DOI: 10.1016/j.bbamem.2021.183604. [COBISS.SI-ID 56646915]
   
   [10] ADAMEK, Maksimiljan. Strukturna in funkcijska primerjava homologov širokospecifične fosfolipaze C iz bakterije Listeria monocytogenes ter karakterizacija njene prooblike : magistrsko delo. Ljubljana: [M. Adamek], 2021. XI f., 117 str., ilustr. [COBISS.SI-ID 85700099]
   
   [11] STRGAR, Mojca. Biofizikalna in strukturna analiza oligomerov listeriolizina O : magistrsko delo : magistrski študij - 2. stopnja = Biophysical and structural analysis of lysterioysin O oligomeres : M. Sc. Thesis : Master Study Programmes. Ljubljana: [M. Strgar], 2019. XIV f., 92, [1] str., ilustr. repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php. [COBISS.SI-ID 5003599]
   
   [12] KUJOVIĆ, Amela. Vpliv mutacij na zgradbo in aktivnost fosfolipaze PC-PLC iz bakterije Listeria monocytogenes : magistrsko delo : magistrski študij - 2. stopnja = Effects of mutations on structure and activity of a phospholipase PC-PLC from bacterium Listeria monocytogenes : M. Sc. Thesis : Master Study Programmes. Ljubljana: [A. Kujović], 2019. XII, 68, [17] f., ilustr. repozitorij.uni-lj.si/IzpisGradiva.php. [COBISS.SI-ID 5191759]