Odseki

Šifra projekta / Project code: J4-60070

Vodja: dr. Miha Modic

1. VSEBINSKI OPIS PROJEKTA
   a. osnovni podatki glede financiranja:
   Projekt financira ARIS v okviru cenovne kategorije A za obdobje 3 let v obsegu 2265 letnimi urami. Pričetek financiranja je 1.1.2025.
   The project is co-financed by ARIS with 2265 annual hours of price class A for a period of 3 years. Funding starts on 1st of January 2025.
   
   b. sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS
   Na Kemijskem inštitutu v projektni skupini sodelujejo / At the National Institute of Chemistry the project group includes:
   Miha Modic; SICRIS 50784; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/46965 
   Anja Trupej; SICRIS 57147; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/54119 
   Jernej Ule; SICRIS 34667; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/39367 
   Valter Bergant; SICRIS 58498; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/55681
   Klara Kuret; SICRIS 54867; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/51518
   Anita Kotar; SICRIS 38338; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/44237 
   Tajda Klobučar; SICRIS 54848; https://cris.cobiss.net/ecris/si/sl/researcher/51519 
   
   Sodelujoče organizacije:
   Inštitut Jožef Stefan
    

2. FAZE PROJEKTA IN NJIHOVA REALIZACIJA
   SLO:
   Regulacija genov je prostorsko in časovno natančno uravnavana na zelo kontekstno odvisen način preko kombinatornih interakcij RNA-vezavnih proteinov, pogosto znotraj ribonukleoproteinskih (RNP) kondenzatov. Te interakcije predstavljajo pomemben mehanizem subcelične kompartementalizacije, ki je temeljna lastnost živih sistemov, potrebna za optimalno učinkovitost in natančno regulacijo bioloških procesov.Za zajem regulatornih proteinov posameznih RNA molekul je bilo predlaganih več pristopov, vendar imajo obstoječe RNA-centrične proteomske metodologije do danes omejeno občutljivost in ločljivost, kljub temu da zahtevajo velike količine celičnega materiala. Poleg tega so alternativne metode RNA pulldowna, povezane z masno spektrometrijo, lahko podvržene artefaktom, ki nastanejo zaradi in vitro asociacij.
   Za premagovanje teh omejitev bomo razvili izboljšan delovni protokol (HCR-Proxy) za zajem regulatornih proteinov posameznih RNA molekul z bistveno izboljšano občutljivostjo, ločljivostjo in prilagodljivostjo. Za doseganje te izjemne specifičnosti smo uporabili pristop ojačanja signala na osnovi hibridizacijske verižne reakcije (HCR) v kombinaciji z in situ strategijo proximity označevanja RNA, usmerjeno z antisense sondami. Ob povečanju občutljivosti smo prostorsko ločljivost dodatno izboljšali z uvedbo crowding reagentov, ki omejijo radij označevanja okoli ciljne RNA med in situ biotinilacijo.
   S tem odpiramo novo področje za identifikacijo naborov RNA-vezavnih proteinov, vezanih na posamezne RNA molekule, z visoko prostorsko in časovno ločljivostjo, kar je bilo prej z uporabo masne spektrometrije težko dosegljivo. Z nadaljnjim razvojem metodologije HCR-Proxy bomo:
   1.) razvili in optimizirali metodo za zajem regulatornih proteinov na izbranih nizko abundantnih RNA molekulah v periimplantacijskih zarodkih in v organotipskih rezinah mišjega tkiva,
   2.) razčlenili in modulirali sestavo RNP kondenzatov, ki jih tvorijo nizko abundantna razvojna lncRNA arc-Efl1 ter hkrati dva ključna sinaptična mRNA vozlišča,
   3.) z visoko subcelično prostorsko-časovno ločljivostjo razjasnili funkcijo specifičnih razvojnih RNP kondenzatov v celičnih kulturah in zarodkih.

   S tem raziskovalnim projektom bomo pridobili poglobljeno razumevanje in vivo sestavljanja regulatornih RNP kompleksov, ki so ključni za aktivnostno odvisna sinaptična in signalno odvisna razvojna vozlišča. Pričakujemo, da bo ta pristop široko uporaben za razumevanje mehanizmov, ki vodijo v motnje procesiranja RNA.

   ANG:
   Gene regulation is spatiotemporally controlled in a highly context-dependent manner through combinatorial interactions of RNA binding proteins, often within ribonucleoprotein (RNP) condensates. These interactions constitute an important mechanism for subcellular compartmentalisation, which is a fundamental property of life required for optimal efficiency and precise regulation of biological processes. Several approaches have been proposed to capture regulatory proteins of individual RNAs, but to date existing RNA-centric proteomic methodologies have limited sensitivity and resolution despite requiring vast amount of cellular material. Moreover, alternative RNA pull-down based methods coupled to mass spectrometry may also be prone to in vitro association artefacts. To overcome these limitations, we have established an enhanced workflow (HCR- proxy) to capture regulatory proteins of individual RNAs with dramatically improved sensitivity, resolution and flexibility. To achieve this unparalleled specificity, we have leveraged the hybridisation chain reaction (HCR) signal amplification approach in conjunction with an in situ antisense probe-directed RNA proximity labelling strategy. Whilst increasing sensitivity, spatial resolution is improved by introducing crowding agents, restricting the radius of labelling around the RNA-of-interest during in situ biotin conjugation. This opens the next frontier to identify the collection of RBPs bound to individual RNAs with high spatiotemporal resolution, which would previously be challenging to characterise by mass-spectrometry. With methodological advancement of HCR-proxy we will further: 
   1.) Spearhead methodology of HCR-proxy to capture regulatory proteins on selected lowly abundant RNAs in peri-implantation embryos and mouse organotypic slice cultures. 
   2.) Delineate and modulate composition of RNP condensates scaffolded by lowly abundant developmental lncRNA arc-Efl1 and in parallel two most prominent synaptic mRNA hubs. 
   3.) understand the function of specific developmental RNP condensates with high subcellular spatio-temporal precision in cell cultures and embryos. 
   
   With this research project we will obtain a detailed understanding of regulatory in vivo RNP assembly of essential activity-dependent synaptic and signal-dependent developmental hubs. We envision this tool to be widely applicable for pinpointing mechanisms underlying RNA processing dysregulation.

3. BIBLIOGRAFSKE REFERENCE, KI IZHAJAJO NEPOSREDNO IZ IZVAJANJA PROJEKTA
   Trupej, A. et al. (2026). HCR-Proxy resolves site-specific proximal RNA microenvironments at subcompartmental resolution. Nucleic Acids Res. (COBISS: 272411651)