Odseki

Šifra projekta: J7-1819

Obdobje trajanja projekta: 1.7.2019 - 30.6.2022

Vodja: prof. dr. Gregor Anderluh

1. VSEBINSKI OPIS PROJEKTA:

   Boj proti povzročiteljem bolezni in protimikrobna odpornost je velik in pereč problem sodobne družbe. Nove strategije in molekulske tarče za razvoj protimikrobnih snovi so zato bistvenega pomena na področjih, kot so medicina, proizvodnja varne hrane, itn. Člani proteinske družine "proteini, ki inducirajo nekroze in sproščanje etilena 1" (NEP1), t.i. proteini NLP, lahko izzovejo različne obrambne reakcije in povzročajo smrt celic pri rastlinah dvokaličnicah, vendar ne pri  enokaličnicah. Proteini NLP so zastopani med taksonomsko nepovezanimi mikroorganizmi, kot so glive, bakterije in oomicete. Ti mikroorganizmi so zelo razširjeni, lahko okužijo vrsto različnih kulturnih rastlin, kot so krompir, paradižnik, soja in tobak, in lahko povzročajo ogromne gospodarske izgube po vsem svetu. Pokazalo se je, da proteini NLP delujejo kot citolitični toksini, ki povzročajo poškodbe plazemskih membran rastlinskih celic, kar povzroča citotoksičnost. Na podlagi podobnosti zgradbe sklepamo, da so proteini NLP sorodni z drugimi toksini živalskega izvora, ki tvorijo pore, kot so npr. aktinoporini iz morskih vetrnic.

   Mehanizem, s katerim proteini NLP povzročajo nekroze in smrt celic, je slabo razumljen. Nedavno smo identificirali glikozilinozitol fosforilceramide (GIPC), glavne rastlinske sfingolipide, kot tarčno molekulo za vezavo proteinov NLP na plazemske membrane (Lenarčič et al., Science, 2017). GIPC-ji so sestavljeni iz polarne glave, ki imajo različno število terminalnih sladkorjev in inozitol fosforilceramidnim delom. Rastline in rastlinska tkiva se zelo razlikujejo v vsebnosti in sestavi različnih GIPC-ev. Vezava terminalnega heksoznega dela GIPC inducira več konformacijskih sprememb znotraj proteina NLP. Temu sledi liza gostiteljskih celic, a o teh nadaljnjih korakih poškodb lipidnih membran se ne ve skoraj nič. V tem projektu želimo testirati osrednjo hipotezo, da proteini NLP poškodujejo lipidne membrane v večstopenjskem procesu, ki vodi do tvorbe por. Glavni cilji predlaganega projekta so torej (i) določitev molekularnega mehanizma poškodb lipidnih membran, (ii) razjasnitev specifičnosti proteinov NLP za membrane dvokaličnic in (iii) določitev strukturnih značilnosti por, ki jih tvorijo proteini NLP na površini lipidnih membran. Pri raziskavah bomo uporabili biokemijske in biofizikalne pristope, metode strukturne biologije kot sta x-žarkovna kristalografija in krio-elektronska mikroskopija in molekulsko modeliranje.

   Rezultati tega projekta bodo omogočili razumevanje molekularne podrobnosti interakcij proteinov NLP s površino tarčnih celic, molekulske mehanizme poškodb lipidnih membran in lastnosti por, ki jih tvorijo proteini NLP. To bo pojasnilo korake v patogenezi mikrobnih patogenov in odprlo poti za razvoj novih strategij v borbi proti njim.

2. Osnovni podatki glede financiranja:
   Projekt financira ARRS v okviru cenovne kategorije C za obdobje treh let v obsegu 2469 letnih ur. Pričetek financiranja je 1. 7. 2019
    
3. Sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS:

   12048; Marjetka Podobnik
   38479; Aleksandra Šakanović
   38473; Tomaž Švigelj
   21684; Tea Tomšič
   53732; Marija Srnko

4. Faze projekta in njihova realizacija

    

   Projekt je razdeljen v več vsebinskih sklopov, ki v osnovi sledijo našim specifičnim raziskovalnim ciljem. Za doseganje le teh bomo uporabili najsodobnejše biokemijske, biofizikalne, molekularne in strukturne biološke pristope.

   Naloga 1: Opis narave poškodbe lipidne membrane s strani proteinov NLP. Glavni cilj te faze bo ugotoviti ali je integriteta membrane porušena s klasičnim oblikovanjem por ali pa NLP inducira kak drug mehanizem za poškodbo membran. V tej fazi bomo pripravili številne modelne membranske sisteme z GIPCi in različne predstavnike NLP, ki bodo ustrezno spremenjeni, da jih bomo lahko spremljali v različnih kontekstih, npr. s fluorescenčno mikroskopijo.

   Naloga 2: Strukturne značilnosti por, ki jih tvorijo NLP proteini. Glavni cilj druge faze bo pridobiti molekularne podrobnosti različnih korakov v mehanizmu nastajanja por in značilnosti por. Uporabili bomo molekulsko modeliranje, da bi dobili boljšo predstavo o dinamiki NLP proteinov v raztopini in ob vezavi na lipidni ligand ali lipidno membrano. Oligomerizirane oblike NLP bodo vizualizirane z elektronsko mikroskopijo.