Odseki

Šifra projekta: J1-2474

Obdobje trajanja projekta: 1. 9. 2019 - 31. 6. 2023

Vodja: dr. Marjetka Podobnik

1. Vsebinski opis projekta:
   Kovalentna povezava med DNA in proteini (angl. DNA-protein crosslink, DPC) je vrsta poškodbe DNA, pri kateri se protein pod vplivom notranjih ali zunanjih faktorjev nepovratno kovalentno veže na DNA. Med notranje spodbujevalce DPC spadajo produkti normalne celične presnove, kot so reaktivne kisikove vrste, aldehidi ali spremembe v helični zgradbi DNA, med zunanje faktorje pa uvrščamo UV svetlobo, ionizirajoče sevanje in različne nevarne kemikalije. DPC so pogoste poškodbe DNA, ki predstavljajo fizično blokado vseh procesov na DNA, kot so podvajanje, prepisovanje, rekombinacija in popravljanje. Če jih molekulski mehanizmi v celici ne popravijo, DPC lahko privedejo do nestabilnosti genoma in razvoja patoloških fenotipov, kot so prezgodnje staranje, nevrodegeneracija in rak. Ker se do nedavnega popravljanje kovalentnih povezav DNA‐protein (angl. DPC repair, DPCR) ni štelo kot ločeno pot popravljanja poškodb DNA, so kljub pogostnosti in resnim posledicam DPC, ti mehanizmi danes še slabo proučeni. V letih 2014 in 2016 je več raziskovalnih skupin identificiralo nove proteaze, Wss1 v kvasovkah in SPRTN pri sesalcih, ki sodelujejo pri odstranitvi DPC preko proteolitične razgradnje proteinov, zamreženih na DNA. Odkritje s proteolizo‐sklopljenih mehanizmov popravljanja DNA je vodilo do spoznanja, da DPCR poteka ločeno od kanoničnih poti popravljanja poškodb DNA, vendar pa je o strukturnih značilnostih in molekularnih mehanizmih tega tipa popravljanja le malo znanega. Do danes so strukturne informacije o DPC in faktorjih, udeleženih v njegovo popravljanje, omejene le na del molekule proteina SPRTN, ki vsebuje aktivno mesto encima. Študije na kvasovkah so pokazale, da bi SPRTN lahko deloval v povezavi s p97, ATP‐odvisno segregazo iz družine AAA ATPaz, ki je poglavitno udeležena v procese DPCR. Poleg tega je znana še ena domnevna proteaza, ACRC (tudi GCNA), ki vsebuje SPRTN‐podobno katalitično domeno. Danes je še vedno zelo malo strukturno znanega o interakciji SPRTN s substrati DPC in segregazo p97, kot tudi biokemijskih ter strukturnih lastnosti ACRC. Cilj študije so (1) karakterizirati kompleks SPRTN:p97 ter ACRC in vitro in in vivo, ter (2) določiti tridimenzionalne strukture kompleksov SPRTN:DPC in SPRTN: p97 ter proteina ACRC z uporabo krio‐elektronske mikroskopije (krio‐EM) ter X‐žarkovne kristalografije. Predlagana raziskava bo razkrila molekulske mehanizme, na katerih temelji DPCR. Pridobljeno znanje bo pomembno vplivalo na razumevanje teh procesov, saj imajo inhibitorji p97 in SPRTN vedno bolj pomembno vlogo pri zdravljenju raka in staranju. Projekt bomo izvajali v sodelovanju z raziskovalno skupino z Inštituta Ruđer Bošković, Hrvaška. Raziskovalci si delijo skupno raziskovalno zanimanje za boljše razumevanje in opis molekulskih interakcij ter mehanizmov bioloških procesov, med drugim tudi za proteolizo ter opis interakcij med proteini ter proteini in nukleinskimi kislinami. Skupni raziskovalni interesi in strokovno znanje bodo zelo pomembni za uspeh tega projekta. Poleg tega je ključni faktor za uspeh projekta tudi komplementarnost med skupinami v smislu metodoloških pristopov kot tudi prenos znanja med sodelujočima mednarodnima skupinama.
    
2. Osnovni podatki glede financiranja:
   Projekt financira ARRS v okviru cenovne kategorije C za obdobje treh let v obsegu 2384 letnih ur. Pričetek financiranja je 1. 9. 2020
    
3. Sestava projektne skupine s povezavami na SICRIS:

   12048; dr. Podobnik Marjetka
   38255; dr. Kežar Andreja
   35382; dr. Kisovec Matic
   50722; Kavčič Luka
   55663; Peric Tanja
   55978; Bembič Primož
    

4. Faze projekta in njihova realizacija
   1. Priprava rekombinantnih proteinov
   2. Strukturne in funkcijske študije kompleksov proteinov (in DNA), vpletenih v DPCR (SPRTN, p97)
   3. Strukturna in funkcijska karakterizacija proteina ACRC
   Projekt se je začel v septembru 2020, vse faze so intenzivno v teku.
    
5.  Bibliografske reference, ki izhajajo neposredno iz izvajanja projekta
   Neposrednih referenc iz projekta še ni, v pripravi.