Odsek za sintezno biologijo in imunologijo
Dve glavni raziskovalni smeri oddelka sta sintezna biologija in molekularna imunologija. Sintezna biologija združuje inženirski pristop in biološke sisteme z namenom uvesti nove lastnosti v biološke ali biomimetične sisteme, vključno s potencialnimi aplikacijami, pa tudi razumeti delovanje kompleksnih bioloških sistemov z izgradnjo od spodaj navzgor. Čeprav sta se obe smeri razvijali neodvisno, smo ugotovili, da je njuna kombinacija skupaj z različnimi eksperimentalnimi tehnikami zelo močna. Glavne raziskovalne teme na področju sintezne biologije vključujejo
i) načrtovane polipeptidne nanostrukture,
ii) inženiring signalizacije in obdelave informacij v sesalskih celicah ter
iii) tehnologije genskega in celičnega zdravljenja.
Raziskave proteinskih nanostruktur, ki jih financira ERC projekta za uveljavljene raziskovalce MaCChines (2018-2024), so osredotočene na načrtovanje sestavljanja proteinov na podlagi modularnih obvitih vijačnic (CCPO). Osnovali smo izvirno platformo za načrtovanje modularnih proteinov na podlagi sklenjenih segmentov, ki tvorijo dimere vijačnic, ki se na podlagi matematično opredeljene poti sami sestavijo v načrtovano obliko. Od izuma te vrste modularnega oblikovanja proteinov, ki se razlikuje od naravnih globularnih proteinov, smo to tehnologijo izpopolnili z dodatnimi prilagodljivimi moduli CC (Drobnak in sod., JACS 2017), novimi oblikami CCPO (različne tetraedrične topologije, pravokotna piramida in trigonalna prizma), ki se samodejno sestavljajo v sesalskih celicah in vivo (pri miših), ne da bi sprožile neželene fiziološke učinke (Ljubetič in sod., Nat.Biotech. 2017), večverižno hierarhično sestavo trigonalne piramide in njeno uravnavanje s proteolizo (Lapenta in sod., Nat.Comm. 2021), načrtovanjem poti zlaganja CCPO, ki omogoča večkratno uporabo istega modula znotraj iste verige (Aupič in sod., Nat.Comm. 2021), s kovinskimi ioni regulirano sestavljanje načrtovanih modularnih proteinskih kletk (Aupič in sod., Sci. Adv. 2022) ter pripravo, karakterizacijo in določitvijo kristalne strukture nanodelcev, ki se vežejo na načrtovane CC module in njihovo vezavo na različne CCPO poliedre (Majerle in sod., PNAS 2021). Nazadnje smo prikazali kristalno strukturo de novo zasnovanega CC origami trikotnika (Satler in sod., JACS 2023) in uporabili zasnovane module, ki tvorijo CC-dimere, za oblikovanje kondenzatov CC-tekoče fazne separacije v sesalskih celicah (Ramšak et al., Nat. Comm. 2023).
Moduli z obvitimi vijačnicami so bili uspešno uporabljeni tudi za uravnavanje bioloških procesov v sesalskih celicah z uvedbo hitrih signalnih poti, ki temeljijo na proteolizi in obvitih vijačnicah, kar omogoča gradnjo logičnih vrat v sesalskih celicah, ki se na kemični signal odzovejo v nekaj minutah in ne urah, kot je potrebno za transkripcijsko uravnavanje (Fink in sod., Nat.Chem.Biol. 2019), za multipleksno celično lokalizacijo, močne regulatorje transkripcije ter močno ojačitev svetlobne in kemične regulacije transkripcije z obvitimi vijačnicami v sesalskih celicah in sklenjene segmente vijačnic (CCCtag), ki omogočajo nastavitev odziva in rekrutiranje različnega števila želenih proteinskih domen (Lebar in sod., Nat. Chem. Biol. 2020), z uvedbo polariziranega izpodrivanja proteinov TALE iz DNK, kjer smo dokazali izpodrivanje proteina TALE, vezanega na DNK, z drugim TALE le v primeru, ko se ta veže na 5', in prikazali nov mehanizem hitre transkripcijske represije (Lebar in sod., Nat. Chem. Biol. 2019), za uravnavanje hitrega izločanja ali membranske translokacije proteinov v sesalskih celicah z reguliranim cepljenjem signala za zadrževanje v endoplazemskem retikulumu in njegovo uporabo za hitro izločanje insulina, protivnetnega citokina in uravnavanje aktivacije celic CAR T (Praznik in sod., Nat. Comm. 2022), za rekrutiranje na podlagi CC-heterodimera eksonukleaze s CRISPR/Cas za izboljšano urejanje genov (Lainšček in sod., Nat. Comm. 2022), za uravnavanje celic s strategijo segmentacije de novo načrtovanih štirivijačnih snopov (Merljak in sod., Nat. Comm. 2023) in za uravnavanje proteinov na podlagi vstavljanja peptida v zanko ciljnega proteina, ki ohrani njegovo funkcijo (Plaper in sod., Cell Discov. 2024).
K uravnavanju bioloških procesov v sesalskih celicah smo pristopili tudi s kemično inducibilnimi sistemi, in sicer z inženiringom inducibilnih razcepljenih proteinskih regulatorjev, pri katerih se ligand-vezavni proteini človeškega izvora razcepijo na dva fragmenta, ki se ponovno sestavita v prisotnosti fiziološkega liganda ali klinično odobrenega zdravila (Rihtar in sod., Nat. Chem. Biol. 2023), in za uravnavanje aktivacije celic CD19 CAR-T na podlagi inženirsko oblikovanih transkripcijskih faktorjev NFAT, katerih aktivnost je mogoče uravnavati s kemično induciranimi sistemi heterodimerizacije (Lainšček in sod., Mol. Ther. Oncolytics 2023).
Na področju molekularne imunologije smo se osredotočili na molekularne mehanizme prirojene imunosti, kjer smo prispevali k razumevanju mehanizma aktivacije inflammasoma NLRP3 in vloge njegove domene LRR ter pokazali, da aktivacija ne poteka prek nukleacijskega dogodka (Hafner Bratkovič in sod., Nat. Comm. 2018) ter mehanizma imunogene celične smrti (piroptoze) z oligomerizacijo gasdermina D, ki jo spodbuja Ragulator (Evavold in sod., Cell 2021). Pokazali smo, da mikrobni produkti in onesnaževalci povečajo oksidativni stres, ki pospešuje porotvorno aktivnost gasdermina D preko direktne spremembe C192 (Devant in sod., Cell Reports, 2023). Pokazali smo, da gasdermin D tvori pore tudi v mitohondrijskih membranah, kar ojača piroptozo (Miao in sod., Immunity 2023). Raziskovali smo vlogo oksidativnega stresa pri aktivaciji TLR4 prek delne oksidacije fosfolipidov in sinergijskega delovanja med fosfolipazo A2 in 15-lipooksigenazo, ki generira endogeni agonist TLR4/MD2 iz zunajceličnih veziklov (Ha in sod., PNAS 2020), ter pojasnili mehanizem prenosa signalnega kompleksa, ki ga sestavlja mutirani MyD88 pri difuznem limfomu celic B, ki je pogost pri Waldenstromovi makroglobulinemiji (WM), in dokazuje medcelični prenos proinflamatornega signala, ki lahko vključi endogeno signalno pot v ciljnih celicah, kar smo dokazali v kostnem mozgu mišičnega modela WM (Manček Keber in sod., Blood 2018). Raziskovali smo tudi mehanizem okužbe s SARS-CoV-2 in pokazali, da lahko tiol-reducirajoči peptidi, ki temeljijo na aktivnem mestu oksidoreduktaze tioredoksina 1, imenovani tioredoksinski mimetični peptidi (TXM), preprečijo nastanek sincicije, ki je pogoj za vstop SARS-CoV-2 v celice in posledično okužbo (Govednik in sod., Antiviral Res. 2023).